知晓抗体全长测序

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一．为什么要进行抗体全长测序

复原单克隆抗体重链和轻链序列的通用方法有两种。比较直接的方法是对B细胞的转录子或遗传物质进行测序。该方法适用于杂交瘤，噬菌体展示，酵母菌展示或单细胞筛选，是抗体测序法中比较具成本效益和比较可靠的方法。但是，源细胞并不一定总是可用的。如果杂交瘤丢失，就可能法获得遗传物质。在这种情况下，可以使用抗体测序来复原抗体序列，例如使用Edman降解或质谱分析技术。

二．抗体测序的分类

1基于Edman降解法的测序：是一种成熟的蛋白质序列测定技术，该技术从N端开始，一次读取一个氨基酸。Edman降解法测序的主要势是样品量要求低（通常需要少于1ug）。Edman降解法测序的质量随着氨基酸加工数量的增加而降低，因此该测序法通常用于确定前30-50个氨基酸，很少用于抗体全序列测定。
2基于质谱的抗体测序法：将抗体分解成15-20个氨基酸长的肽，然后在质谱仪中进行分析。在理想情况下，每种肽都可产生片段图谱。进行抗体从头测序时，需要对每个片段图谱进行解析并揭示抗体的一部分序列。通常，我们用具有不同切割基序的多种酶来分解抗体，从而确保抗体的每个区域均可产生几个重叠肽。通过产出重叠肽，抗体测序技术可以以类似于鸟法测序组装基因组的方式重组抗体序列。
3肽谱分析和抗体从头测序：肽谱分析的目标是确认已知序列，抗体从头测序是从片段图谱或图谱集合中获得之前未知序列的过程。与抗体从头测序相比，肽谱分析需要的酶解次数和质谱运行次数往往更少，这就意味着花费可以更低。

．蛋白质从头测序技术

蛋白质从头测序技术（DeNovoSequencing）是利用串联质谱（MSMS）获取离子，根据两个片段离子之间的质量差来计算肽链上氨基酸残基的质量，从而得到蛋白的氨基酸序列的分析过程。该技术主要针对未知物种的基因组序列，构建不同类型的基因组DNA文库，并进行序列测定。然后通过生物信息学的方法对测序所得到的序列进行拼接、组装和注释，从而获得该物种完整的基因组序列图谱。利用全基因组从头测序技术，可以获得动物、植物、细菌、以及真菌的全基因组序列，从而推进该物种的研究。

四．从头测序技术验流程

先对样品进行多酶解验，将酶解后的肽段进行质谱检测，数据采集后的质谱图用denovo算法进行解析并获得对应的肽段序列，经过肽段间的比对拼接，从蛋白N端到C端拼装出来，得到蛋白的氨基酸序列。
目前可通过液相色谱与ObitrapFusion高分辨质谱仪联用，建立蛋白从头测序（DeNovoSequencing）平台，保证了低丰度肽段碎裂片段鉴定的灵敏度，同时在肽段碎裂过程中采取HCD与ETD结合的碎裂模式，对亮氨酸异亮氨酸这对同分异构体进行区分。

五．数据分析

（1）肽段覆盖率基于特异性和非特异性蛋白酶（Trypsin、Chymotrypsin、Glu-C、Lys-C、Pepsin、Elastase等）分别对蛋白样品进行酶切，使蛋白覆盖率达到100%和产生丰富的、重叠度高的肽段类型，比较终得到测序所需的高质量数据。
（2）肽段拼接采用HCD会产生一系列by离子，根据这些离子信息来推导肽段的序列。但是由于多种酶切会产生很多重复肽段，所以要对肽段进行一系列筛选。首先要选择高峰度的肽段，其是判断肽段二级离子的碎裂。但是当碎片离子缺失时，数据库搜索可能仍然成功。故为了提高从头测序准确性，采用的方法可能结合不同离子片段化技术产生多个谱图。
（3）亮氨酸与异亮氨酸区分在过去Leu和Ile通常被认为法被MS区分，因为它们的分子质量完全相同。在可变结构域中定位不正确的LeuIle残基，特别是在抗体的CDR（互补性决定区）中，可能导致抗原结合亲和力和抗体特异性的质性丧失。
（4）亮氨酸和异亮氨酸在ETD碎裂条件下可以得到cz离子，再辅助HCD碎裂，在z离子基础上脱掉一部分基团，形成w离子。亮氨酸脱掉丙基，形成43Da的丢失；异亮氨酸脱掉乙基，形成29Da的丢失。
（5）数据验证：分子量验证通过蛋白质分子量（完整，还原，脱糖，脱糖还原）可以获得蛋白质的基本修饰信息（氧化、脱酰胺、N端环化、C末端K缺失、糖基化修饰），从而验证DeNovo得到的蛋白序列。DeNovo测定得到的序列建立新的数据库，对采集到的质谱数据再次进行覆盖率分析，得到几乎完全匹配的结果。

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